西北高原所在杨树WRKY转录因子调控植物抗病性研究方面获进展

　　2014年12月，国际学术期刊《Journal of Experimental Botany》在线发表了中国科学院西北高原生物研究所青藏高原植物适应与进化学科组研究员罗克明的最新研究进展：通过全基因组分析和数字表达谱筛选得到可以显著提高杨树对溃疡病抗性的PtrWRKY89转录因子（Genome-wide identification and characterization of the Populus WRKY transcription factor family and analysis of their expression in response to biotic and abiotic stresses, Journal of Experimental Botany, DOI: 10.1093/jxb/eru381, 2014）。该工作由西南大学姜渊忠、段艳娇及西北高原所罗克明、张发起等研究人员合作完成。 

　　WRKY转录因子是一类广泛存在于植物中的转录因子家族，大量研究表明WRKY转录因子广泛参与了植物胁迫反应，木质素形成，种子萌发等各种生理过程，尤其在植物抵抗病原微生物侵害的过程中扮演了十分重要的角色。WRKY转录因子不仅可以激活植物抗毒素和细菌水解酶类等基因的表达，还参与调控植物中抗病信号分子如水杨酸、茉莉酸的合成。目前，已经有少量文献报道了某些WRKY转录因子可以改变杨树对病原菌的抗性，但是具体的调控机理还一无所知。因此通过分子生物学的方法弄清杨树中WRKY转录因子在抗病途径中的调控网络对于将来通过基因工程的方法来筛选获得杨树抗病良种至关重要。 

　　本研究通过杨树全基因组分析发现毛果杨基因组上存在至少100个WRKY基因。结合拟南芥等不同物种的WRKY蛋白，对100个杨树WRKY成员进行了系统发育分析，将杨树WRKY成员分为了3个大类，7个小类和一个独立成员，并且比对了这些蛋白的WRKY结构域发现第一大类的成员都具有两个WRKY结构域，而第二和第三大类的成员虽然都只有一个结构域但是其锌指结构不同。通过启动子分析发现杨树的WRKY基因启动子区域分布着各种与植物抗病抗逆应答的cis-acting元件，数字表达谱分析了毛果杨在水杨酸，茉莉酸，黑斑病，机械损伤，低温和盐胁迫六种处理下WRKY转录因子的表达量变化，结果显示100个杨树WRKY成员中有61个成员的表达较对照组有显著性差异，绝大多数基因在不同处理下受到诱导。这些结果表明杨树WRKY转录因子家族广泛参与了杨树抗病抗逆的生理过程。通过定量PCR和半定量PCR进一步分析WRKY基因对不同处理的应答情况发现PtrWRKY89受水杨酸诱导十分显著并且在水杨酸处理早期就表现出了很高的表达水平，因而推测PtrWRKY89很可能与杨树中水杨酸介导的抗病途径有关。为了验证这一假设，姜渊忠及段艳娇等人通过农杆菌介导的方法得到了过量表达PtrWRKY89的毛白杨植株，并用溃疡病接种叶片，结果显示和野生型毛白杨相比，过表达植株的坏死斑更小，表明其抗病性得到了显著提升。通过检测水杨酸抗病途径基因在过表达株系中的表达情况发现，PR基因等和细菌水解酶类相关的基因表达量得到了显著提高。但是在杨树中WRKY转录因子是直接还是间接调控PR基因，在国内外还没有报道。此项研究筛选得到了PtrWRKY89转录因子，证明了其在抗病途径中扮演的角色，并为找到其靶基因提供了线索。 

　　近年来以杨树为代表的速生树种逐渐成为生物能源研究领域的理想材料，但是由于栽培量大，树种单一，病害的威胁日益凸显，因此如何增强杨树的抗病性是解决这一问题的重要手段。该学科组经过几年发展，拥有了成熟的体系较为完善的杨树功能基因筛选技术、杨树转基因技术和病原体侵染技术，能够定向、高效筛选抗病相关基因并鉴定其功能。该学科组通过相关技术，从外源结构基因、內源结构基因和內源转录因子等不同层面研究了不同基因对杨树抗病性的影响，并在国内外权威期刊上发表论文多篇。今年12月，该课题组叶胜龙等通过同源比对的方法找到了杨树中PtrWRKY60可以正向调控杨树对溃疡病的抗性。这一系列工作的完成，为通过基因工程手段增强杨树抗病性提供了候选基因，进一步解析了杨树抗病过程的转录调控网络。 

　　该研究得到国家自然基金面上项目、国家转基因重大项目等项目的资助。 （撰稿人：张发起）

　　与本报道相关学术论文： 

　　1.Yuanzhong Jiang, Yanjiao Duan, Jia Yin, Shenglong Ye, Jingru Zhu, Faqi Zhang, Wanxiang Lu, Di Fan, Keming Luo^*, Genome-wide identification and characterization of the Populus WRKY transcription factor family and analysis of their expression in response to biotic and abiotic stresses, Journal of Experimental Botany, DOI: 10.1093/jxb/eru381, 2014. 

　　2.Shenglong Ye, Yuanzhong Jiang, Yanjiao Duan, Abdul Karim, Di Fan, Li Yang, Xin Zhao, Jia Yin, Keming Luo. Constitutive expression of the poplar WRKY transcription factor PtoWRKY60 enhances resistance to Dothiorella gregaria Sacc. in transgenic plants, Tree Physiology 00, 1–12 (doi:10.1093/treephys/tpu079). 

　　3.Wen Mengling, Gao Yuan, Wang Lijun, Ran Lingyu., Li Jiahui, Luo Keming*. Split-Cre Complementation Restores Combination Activity on Transgene Excision in Hair Roots of Transgenic Tobacco. PloS one, 9(10), e110290, 2014. 

Jiang Yuanzhong, Ye Shenglong, Duan Yanjiao, Lu Wanxiang, Liu Hong, Fan Di, Zhang Faqi, Luo Keming^*, Heterologous gene silencing induced by tobacco rattle virus (TRV) is efficient for pursuing functional genomics studies in woody plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 116(2): 163-174, 2014.

杨树WRKY转录因子对不同处理的应答情况